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FRET熒(ying)光(guang)標記(ji)技術

      熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)標(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)所依賴(lai)的(de)化(hua)(hua)合物(wu)(wu)稱為(wei)(wei)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)物(wu)(wu)質。熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)物(wu)(wu)質是指(zhi)具有(you)共軛(e)雙鍵體系(xi)化(hua)(hua)學(xue)結構的(de)化(hua)(hua)合物(wu)(wu)，受到紫外光(guang)(guang)(guang)(guang)或藍(lan)紫光(guang)(guang)(guang)(guang)照(zhao)射時，可(ke)激發(fa)(fa)(fa)成(cheng)為(wei)(wei)激發(fa)(fa)(fa)態(tai)，當(dang)從激發(fa)(fa)(fa)態(tai)恢復基態(tai)時，發(fa)(fa)(fa)出熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)。熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)標(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)技(ji)術指(zhi)利(li)用(yong)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)物(wu)(wu)質共價結合或物(wu)(wu)理吸附在所要研究分子的(de)某個基團上，利(li)用(yong)它(ta)的(de)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)特性(xing)來提(ti)供被研究對象的(de)信息。熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)標(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)無放射物(wu)(wu)污染，操作簡便等優(you)點，使得熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)標(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)物(wu)(wu)在許多(duo)研究領域的(de)應用(yong)日趨廣泛。人們利(li)用(yong)利(li)用(yong)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)標(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)多(duo)肽(tai)來檢測目標(biao)蛋白的(de)活(huo)性(xing)，并將其發(fa)(fa)(fa)展的(de)高(gao)通量活(huo)性(xing)篩選(xuan)方法應用(yong)于疾病治(zhi)療(liao)靶點蛋白的(de)藥(yao)物(wu)(wu)篩選(xuan)和藥(yao)物(wu)(wu)開發(fa)(fa)(fa)（例(li)如，各(ge)種(zhong)激酶(mei)、磷酸(suan)酶(mei)、肽(tai)酶(mei)等）。肽(tai)谷生物(wu)(wu)經過長(chang)期開發(fa)(fa)(fa)，能夠提(ti)供技(ji)術成(cheng)熟的(de)各(ge)種(zhong)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)標(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)多(duo)肽(tai)。

  • 熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET)

          熒光共振能量轉移（FRET)是一種非輻射能量躍遷，通過分子間的電偶極相互作用，將供體激發態能量轉移到受體激發態的過程。此過程沒有光子的參與，所以是非輻射的。該分析方法具有快速、敏感和簡單等優點。
          用于FRET試驗的染料是可以相同的。但在大多數應用中其實是使用不同的染料。例如，一個供體基團（EDANS）和接受基因（DABCYL）勻被連接到一HIV蛋白酶的天然底物上，當該底物未被切斷時，DABCYL可淬滅EDANS，從而檢測不到熒光。當該底物被HIV-1蛋白酶切斷后，EDANS不再被DABCYL淬滅，隨即可檢測到EDANS熒光。蛋白酶抑制劑的有效性可憑借EDANS熒光強度的變化進行監測。
          FRET肽(tai)是(shi)研究肽(tai)酶(mei)特(te)異性(xing)的(de)(de)(de)便利工(gong)具，由(you)于其反(fan)應過(guo)程可(ke)(ke)被(bei)連(lian)續(xu)監測，為酶(mei)活性(xing)的(de)(de)(de)檢(jian)(jian)測提(ti)供(gong)了一個(ge)便捷的(de)(de)(de)方法(fa)。供(gong)體/受(shou)體對(dui)(dui)(dui)的(de)(de)(de)肽(tai)鍵(jian)水(shui)解后產生的(de)(de)(de)熒(ying)(ying)光可(ke)(ke)衡量納摩爾級濃度(du)的(de)(de)(de)酶(mei)活性(xing)。當FRET肽(tai)是(shi)完整的(de)(de)(de)，表現出的(de)(de)(de)是(shi)內部的(de)(de)(de)熒(ying)(ying)光猝滅，但(dan)當供(gong)體/受(shou)體對(dui)(dui)(dui)的(de)(de)(de)任何肽(tai)鍵(jian)斷裂就(jiu)會(hui)釋(shi)放出熒(ying)(ying)光，此熒(ying)(ying)光可(ke)(ke)被(bei)連(lian)續(xu)檢(jian)(jian)測，從而可(ke)(ke)對(dui)(dui)(dui)酶(mei)的(de)(de)(de)活性(xing)進行定量分析。FRET 肽(tai)可(ke)(ke)作為各類酶(mei)研究的(de)(de)(de)合適底物，比(bi)如：肽(tai)酶(mei)、蛋白酶(mei)、激酶(mei)、磷酸酶(mei)的(de)(de)(de)動力(li)特(te)征(zheng)和功(gong)能(neng)特(te)征(zheng)；對(dui)(dui)(dui)新的(de)(de)(de)蛋白水(shui)解酶(mei)的(de)(de)(de)篩(shai)選和檢(jian)(jian)測；對(dui)(dui)(dui)多肽(tai)折(zhe)疊的(de)(de)(de)構(gou)象研究等。

  • ·常用FRET的標準染料組合

    Fluorescein and Dabcyl:FAM/Lys(Dabcyl)
    Fluorescein and Tamra: FAM/TAMRA
    Methoxy-coumarin-acetic-acid(MCA)
    and 2,4-Dinitrophenyl(DNP):     MCA/Lys(Dnp).
    Ortho-aminobenzoic acid (Abz)
    and 2,4-dinitrophenyl (Dnp)
    Abz/Tyr (NO2) or N-(2,4-dinitrophenyl)ethylenediamine (EDDnp):     Abz/Tyr (NO2)
    Abz/EDDnp
    Dabcyl and Glu(EDANS)： Dabcyl/Glu(EDANS)

  • ·FRET共振能量轉移引發熒光猝滅的激發與發射波

  • 猝滅劑

    熒光團

    激發波(nm)

    發射波(nm)

    Dabcyl

    Edans

    336

    490

    Dansyl

    Trp

    336

    350

    DNP

    Trp

    328

    350

    DNP

    MCA

    328

    393

    DNP

    Abz

    328

    420

    Tyr (NO2)

    Abz

    320

    420

  • · 常規FRET供體(Donor)-接受(Aceptor)對的福斯特臨界距離(Forster Critical Distance)

    供體

    受體

    福斯特臨界距離(nm)

    Tryptophan

    Dansyl

    2.1

    IAEDANS (1)

    DDPM (2)

    2.5-2.9

    BFP

    DsRFP

    3.1-3.3

    Dansyl

    FITC

    3.3-4.1

    Dansyl

    Octadecylrhodamine

    4.3

    CFP

    GFP

    4.7-4.9

    CF (3)

    Texas Red

    5.1

    Fluorescein

    Tetramethylrhodamine

    4.9-5.5

    Cy3

    Cy5

    5.0

    GFP

    YFP

    5.5-5.7

    BODIPY FL (4)

    BODIPY FL (4)

    5.7

    Rhodamine 6G

    Malachite Green

    6.1

    FITC

    Eosin Thiosemicarbazide

    6.1-6.4

    B-Phycoerythrin

    Cy5

    7.2

    Cy5

    Cy5.5

    >8.0

          (1): 5-(2-iodoacetylaminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid
          (2): N-(4-dimethylamino-3,5-dinitrophenyl) maleimide
          (3): carboxyfluorescein succinimidyl ester
          (4): 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene

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