多肽磷酸化標記技術
磷(lin)(lin)酸(suan)化(hua)(hua)影(ying)響(xiang)著細(xi)胞(bao)生(sheng)命的(de)(de)方方面(mian)面(mian)。在細(xi)胞(bao)中，大概(gai)有1/3的(de)(de)的(de)(de)蛋白質被認(ren)為是通過磷(lin)(lin)酸(suan)化(hua)(hua)修(xiu)飾的(de)(de)。蛋白質的(de)(de)磷(lin)(lin)酸(suan)化(hua)(hua)修(xiu)飾與多(duo)(duo)種生(sheng)物學過程密(mi)切相關，如DNA損(sun)傷(shang)修(xiu)復、轉錄調節、信號(hao)傳(chuan)導(dao)、細(xi)胞(bao)凋亡的(de)(de)調節等。磷(lin)(lin)酸(suan)化(hua)(hua)蛋白質及多(duo)(duo)肽(tai)的(de)(de)研究可(ke)以(yi)幫助人(ren)們闡述上述過程的(de)(de)機理，進一步認(ren)識生(sheng)命活動的(de)(de)本(ben)質。肽(tai)谷生(sheng)物依(yi)據自身原料優(you)勢和技術(shu)優(you)勢，可(ke)以(yi)合成含(han)有磷(lin)(lin)酸(suan)化(hua)(hua)絲氨(an)酸(suan)(pSer)、磷(lin)(lin)酸(suan)化(hua)(hua)蘇(su)氨(an)酸(suan)(pThr)、磷(lin)(lin)酸(suan)化(hua)(hua)酪氨(an)酸(suan)(pTyr)的(de)(de)多(duo)(duo)肽(tai)，并可(ke)以(yi)提供含(han)有一個(ge)，兩個(ge)，三個(ge)，四(si)個(ge)，五個(ge)磷(lin)(lin)酸(suan)化(hua)(hua)位(wei)點修(xiu)飾的(de)(de)高質量多(duo)(duo)肽(tai)。
磷酸化多肽主要指肽鏈中的Ser、Tyr和Thr殘基的側鏈羥基被修飾成酸式磷酸酯多肽。磷酸化多肽是研究蛋白質磷酸化過程的必不可少的工具，因此研究蛋白質及多肽的磷酸化反應并確定成熟簡便的合成路線就變得非常重要。目前，多肽的磷酸化修飾方法主要有兩種：
（1）將適當保護的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中；
（2）多肽序列在樹脂上合成完后，再對其中的Ser、Tyr或Thr的側鏈羥基進行磷酸化。
即(ji)事先將需(xu)要(yao)磷酸(suan)化(hua)(hua)的氨基(ji)酸(suan)（Thr,Ser或Tyr）磷酸(suan)化(hua)(hua)并適當(dang)保護，然后按(an)照(zhao)正常SPPS合成流程將磷酸(suan)化(hua)(hua)單(dan)體縮(suo)合到多肽指定位(wei)點。這種方法(fa)操(cao)作(zuo)簡便(bian)，已經(jing)成為多肽單(dan)位(wei)點磷酸(suan)化(hua)(hua)修飾的主要(yao)方法(fa)。
采(cai)用將(jiang)磷(lin)(lin)(lin)(lin)酸化(hua)(hua)(hua)單體(ti)縮(suo)合(he)到多(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)中(zhong)的(de)方(fang)(fang)法進(jin)行(xing)磷(lin)(lin)(lin)(lin)酸化(hua)(hua)(hua)修(xiu)(xiu)(xiu)飾時(shi)，磷(lin)(lin)(lin)(lin)酸化(hua)(hua)(hua)的(de)氨(an)基(ji)(ji)酸由于側鏈修(xiu)(xiu)(xiu)飾的(de)較(jiao)(jiao)大基(ji)(ji)團產生(sheng)的(de)位阻而導致難(nan)以與(yu)肽(tai)(tai)(tai)鏈縮(suo)合(he)，并且之后(hou)的(de)氨(an)基(ji)(ji)酸引入都會比較(jiao)(jiao)困(kun)難(nan)，尤其在(zai)(zai)含有多(duo)(duo)個磷(lin)(lin)(lin)(lin)酸化(hua)(hua)(hua)位點修(xiu)(xiu)(xiu)飾時(shi)，合(he)成(cheng)將(jiang)變得異常困(kun)難(nan)，并且最終產物(wu)成(cheng)分復雜，難(nan)以分離，產率極低。因此，當(dang)肽(tai)(tai)(tai)鏈中(zhong)多(duo)(duo)個位點進(jin)行(xing)磷(lin)(lin)(lin)(lin)酸化(hua)(hua)(hua)時(shi)，可(ke)以考(kao)慮采(cai)用將(jiang)多(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)序列在(zai)(zai)樹脂上合(he)成(cheng)完(wan)(wan)后(hou)，再對其中(zhong)的(de)Ser、Tyr或Thr的(de)側鏈羥基(ji)(ji)進(jin)行(xing)磷(lin)(lin)(lin)(lin)酸化(hua)(hua)(hua)：其合(he)成(cheng)過程主要就是(shi)在(zai)(zai)多(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)合(he)成(cheng)結束之后(hou)，選(xuan)擇(ze)性的(de)脫去要標記氨(an)基(ji)(ji)酸的(de)側鏈保護(hu)基(ji)(ji)，對于Tyr，Thr可(ke)以直(zhi)接使用側鏈不(bu)保護(hu)的(de)氨(an)基(ji)(ji)酸進(jin)行(xing)反(fan)應(ying)。側鏈保護(hu)基(ji)(ji)在(zai)(zai)1%TFA/DCM條件(jian)下(xia)可(ke)以定量(liang)的(de)脫除。采(cai)用這種方(fang)(fang)法時(shi)，可(ke)以采(cai)用雙芐基(ji)(ji)亞(ya)磷(lin)(lin)(lin)(lin)酰胺，四氮(dan)唑生(sheng)成(cheng)亞(ya)磷(lin)(lin)(lin)(lin)酰胺四唑活性中(zhong)間體(ti)，連接到羥基(ji)(ji)上，然后(hou)在(zai)(zai)過氧酸條件(jian)下(xia)氧化(hua)(hua)(hua)生(sheng)成(cheng)磷(lin)(lin)(lin)(lin)酰基(ji)(ji)，完(wan)(wan)成(cheng)反(fan)應(ying)。
激酶活性檢測
在(zai)體外(wai)，激(ji)酶(mei)活性的(de)檢(jian)測是(shi)將經免疫沉(chen)淀法(fa)獲得的(de)蛋白(bai)激(ji)酶(mei)與某一底物(wu)在(zai)ATP環境下共同孵育(yu)，然后再檢(jian)測。磷(lin)酸化底物(wu)的(de)測量(liang)可(ke)以通過報告系統(tong)如比色法(fa)、放射性或熒光檢(jian)測而得。
磷酸化(hua)特定性抗體的開發
磷(lin)酸化抗(kang)體(ti)已(yi)被許(xu)多(duo)(duo)研究者使用。首先合成磷(lin)酸化多(duo)(duo)肽，即圍繞靶蛋白(bai)磷(lin)酸化位點(dian)的氨基酸序列(lie)，接著共(gong)軛偶(ou)聯(lian)至血藍(lan)蛋白(bai)(KLH)上進(jin)行免(mian)疫。免(mian)疫血清將流經多(duo)(duo)肽親和(he)層析柱(zhu)， 從而得到一個(ge)非常特異的免(mian)疫制劑。檢測的成功與否(fou)取決于抗(kang)體(ti)對(dui)靶磷(lin)酸化蛋白(bai)的特異性和(he)親和(he)力(li)。
免疫印跡（Western Blot）
許(xu)多磷酸(suan)化抗體是十分敏感的，可以(yi)很容(rong)易地檢測到(dao)常規樣品中的磷酸(suan)化蛋(dan)白。化學發光和比色(se)法(fa)都是較常見的檢測方法(fa)，蛋(dan)白Markers通常用來為蛋(dan)白質(zhi)量(liang)提(ti)供標(biao)準。
酶聯免疫吸附試驗(ELISA)
ELISAs提供一(yi)種間(jian)接測量(liang)激酶活性的(de)(de)方(fang)法，其比WB更容易定量(liang)。磷酸化特異(yi)的(de)(de)ELISA技術可以很輕(qing)易地(di)通(tong)過使用一(yi)個(ge)校準標準來量(liang)化結(jie)果。通(tong)過雙(shuang)抗(kang)體(ti)夾心方(fang)法，應用兩個(ge)靶(ba)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)特異(yi)性抗(kang)體(ti)可使檢測呈現高特異(yi)性。此外,基于微(wei)孔板(ban)的(de)(de)ELISAs檢測，更是具有高通(tong)量(liang)、 微(wei)量(liang)和對低豐度蛋(dan)白(bai)檢測的(de)(de)特點。
細(xi)胞ELISA（Cell-Based ELISA）
通過分析(xi)完整的細(xi)胞中磷(lin)酸化(hua)(hua)蛋(dan)白，可更準(zhun)確地反應特(te)性的信(xin)號網絡(luo)狀態(tai)。一般磷(lin)酸化(hua)(hua)抗(kang)體多通過熒光或比色法來(lai)檢(jian)測磷(lin)酸化(hua)(hua)狀態(tai)。
流式(shi)細(xi)胞術(FCM)和ICC/IHC
流式細(xi)胞術(shu)因其快速、定(ding)量(liang)、單細(xi)胞分析(xi)等(deng)特點(dian)而非常具有優勢。細(xi)胞被誘導后(hou)，通過甲(jia)(jia)醛(quan)或多聚甲(jia)(jia)醛(quan)將其與磷酸化(hua)蛋白交聯(lian)固(gu)定(ding)，然后(hou)分析(xi)。固(gu)定(ding)的細(xi)胞需經通透(tou)處理，以便磷酸化(hua)抗體的進入(ru)。
質譜分析（Mass Spectrometry）
質譜(MS)技術是一項用(yong)于識(shi)別磷(lin)酸(suan)化蛋(dan)白、磷(lin)酸(suan)化多肽和磷(lin)酸(suan)化殘基(ji)(ji)序列的(de)便利工具。利 用(yong)MS卓越的(de)靈敏(min)度和分辨(bian)率，可(ke)識(shi)別某一單(dan)個蛋(dan)白質或(huo)多肽。但來(lai)自磷(lin)酸(suan)化多肽的(de)信號(hao)通常較弱(ruo)，因而新的(de)技術正(zheng)在(zai)被研發(fa)以增(zeng)強MS信號(hao)。這些策略包括固化金(jin)屬(shu)親和層析，磷(lin)酸(suan)化抗體的(de)豐富(fu)，化學修飾方(fang)法和用(yong)生物素部份置換磷(lin)酸(suan)基(ji)(ji)團。
xMAP(flexible Multi-Analyte Profiling) 技術
Multi-Analyte profiling技術(shu)涉及磷酸(suan)化(hua)抗(kang)體的應用和基于微孔板(ban)及膜的檢測(ce)方(fang)式。這些(xie)檢測(ce)技術(shu)可提(ti)供大量的數(shu)據，卻只需極(ji)少(shao)量的樣本。然(ran)而，這些(xie)檢測(ce)技術(shu)并不比傳統的檢測(ce)方(fang)法敏感，原因在(zai)于潛在(zai)的抗(kang)體交叉反(fan)應。
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